[xSight] Total Holographic Characterization(THC)기술을 이용한 Polysorbate80 붕괴에 따른 IgG 응집 모니터링

Total Holographic Characterization(THC)는 각 입자가 가지는 고유한 홀로그램 특징을 바탕으로 하여 Lorenz-Mie이론을 통해 각 입자의 크기와 굴절률을 측정할 수 있습니다. 이렇게 측정된 값을 바탕으로 입자 유형을 계산하며 측정된 부피로 나누어 농도를 산출하는 기술입니다.

이러한 기술은 콜로이드 미소구체, 에멀젼 액적 또는 응집체나 응집체를 포함한 불규칙 입자(불순물)과 같은 부유 입자를 높은 정밀도와 신뢰성을 가지는 비파괴적 정량분석이 가능합니다. Spheryx xSight는 제형 최적화, 품질 보증 스크리닝, 제조 공정 제어 및 샘플 분석을 위한 미립자 현탁액의 거동에 대한 예측을 손쉽게 할 수 있습니다. 

(THC 기술 모식도)

Spheryx xSight

이번 어플리케이션은 Spheryx xSight의 THC 기술을 응용하여 IgG항체에 포함된 Polysorbate80(Tween80)의 구조 붕괴에 따른 IgG입자의 거동에 대해 측정하였습니다.

Polysorbate80(Tween80, PS80)은 올레산(Oleic acid)와 리놀레산(Linoleic acid)가 포함된 계면활성제로 항체 안정화를 위해 널리 사용되는 물질 중 하나입니다.

이 Polysorbate80이 시간이 지남에 따라 자연적으로 구조가 붕괴됨에 따라 유기산이 떨어져 나오게 됩니다. 이러한 현상은 항체 주사제의 생물학적 제제의 유효기간을 단축시키거나 기타 부작용이 발생할 수 있는 위험성을 내포하고 있습니다. 이러한 유기산(Free fatty acid, FFA)을 측정하는 것은 효과적인 QC 검사로 볼 수 있습니다.

아래 그림은 xSight 장비를 이용하여 각 물질의 particle 분포를 나타냅니다.

각각 PS80, 올레산, PS80 구조가 붕괴된 샘플을 측정하였습니다.

(*파란색 baseline : H2O Refractive index)

이렇게 측정된 결과를 바탕으로 보아, 정상적인 PS80의 경우 Refractive Index 검출이 되지 않으나, 올레산의 경우 1.4~1.5사이에서 크게 검출이 되며, PS80 붕괴 샘플에서도 Refractive Index가 검출이 됨을 확인할 수 있습니다. 이는 PS80 붕괴 시 Oleic acid(FFA)가 떨어져 나온 것을 추론할 수 있습니다.

다음으로는 지방분해 효소인 라이페이스(Lipase)를 PS80에 첨가하여 PS80의 구조 붕괴를 모니터링 하였습니다.

(Pseudomonas Cepacian의 라이페이스를 PS80이 포함된 37℃ Acetic acid buffer 샘플에 첨가하였습니다(3EA))

각각 샘플이 시간이 경과함에 따라 Oleic acid의 농도가 증가함을 확인할 수 있습니다.

다음으로는, 항체가 포함된 용액에 라이페이스, PS80을 첨가하여 모니터링을 진행하였습니다.

(대조군 : IgG + PS80, IgG + 라이페이스, PS80 + 라이페이스)

해석된 결과는 IgG에 포함된 PS80이 붕괴됨에 따라 FFA가 증가하고, 이것이 IgG의 Aggregation을 야기시키는 것을 확인할 수 있습니다.

맨 우측 (d)그래프상 Diameter 2μm, H2O Refractive index에 근접한 곳에서 높은 농도로 관찰이 되는 것을 확인할 수 있습니다(주황색)

이는 2μm의 크기를 가지는 물질이 다수 포착이 되었다는 의미이며 (h)의 그래프를 보면 구형, 막대기, 그외 형태의 물질이 생겨남을 확인할 수 있습니다.

단백질 응집체는 초기 형태는 구형에 가까우며(파란색), 응집이 일어날 수록 막대모양(Rod-Like)이 되고(노란색), 더욱 응집이 진행이 되면 매우 불규칙한 형태를 띄게 됩니다(빨간색)

이를 통해 항체 의약품의 계면활성제가 붕괴됨에 따라 단백질 응집에 의해 약리학적 활성이 사라지는 것을 확인할 수 있고, 약제 품질 관리에 유의미하게 적용시킬 수 있다는 것을 확인할 수 있었습니다.

마지막으로, 항체 주사액을 주입할 때 사용하는 주사기에는 불순물인 실리콘 오일이 포함이 되어있습니다.

예를 들어 안구주사 시 묻어나오는 실리콘 오일이 염증 반응을 일으키는 문제를 야기시키는 것으로 알려져 있습니다.

(참조 : Differences in the incidence of aflibercept-related sterile endophthalmitis according to types of disposable syringes used, 2022)

이 실리콘 오일은 Refractive index 1.4에 근접한 값을 가지고 있습니다.

이를 바탕으로 앞서 진행한 Acetic acid buffer solution(PS80 included)를 바탕으로 실리콘 오일이 첨가되었을 때 경향을 확인하였습니다.

그림 (a)는 PS80 Buffer solution에 실리콘 오일이 포함된 상태입니다. Refractive index 1.4 부근에 입자가 다량으로 검출된 것을 확인할 수 있고, (d) 그래프를 보시면 구형 입자가 다량으로 검출되는 것을 알 수 있습니다.

그림 (c)는 PS80 Buffer solution에 라이페이스를 첨가하여 구조 붕괴를 유도하였고, 여기에 실리콘 오일을 첨가한 상태에서 입자를 분석한 도표입니다. 

비슷한 크기의 입자가 동시에 검출이 되는 것을 확인할 수 있으며, Refractive index 1.5부근은 PS80의 붕괴 구조, 1.4부근은 실리콘 오일이 확인되었습니다.

이와 같이 비슷한 입자크기를 가짐에도 불구하고 각 물질의 홀로그래픽 특성의 차이를 이용하여 입자를 완벽히 규명하고 정확한 정량분석이 가능하여 유의미한 입자 크기 분석이 가능할 수 있습니다.